封面 作者介绍 书名页 版权页 《基因工程实验指南》编委会 前言 目录 第一章 仪器设备 分子生物学实验室常用仪器设备简介 一、实验原理 1.恒温气浴摇床 2.超净工作台 3.低温台式高速离心机 4.微量移液管 5.电泳仪 6.PCR仪 7.灭菌锅 8.冷冻离心机 9.数字式酸度计 10.分光光度计 11.分析天平 二、实验仪器 三、操作步骤 1.恒温气浴摇床的使用 2.超净工作台的使用 3.低温台式高速离心机的使用 4.微量移液管的使用 5.PCR的使用 6.电泳仪的使用 7.高压灭菌锅 8.冷冻离心机 9.数字式酸度计 10.分光光度计 11.分析天平 第二章 核酸 第一节 核酸的构成 1.化学 2.物理 3.光谱学 4.热力学 5.核酸的大小和测定 6.核酸的水解 7.核酸的变性、复性和杂交 8.核酸的分类 9.核酸的组成 10 .核酸的连接方式 第二节 基因组DNA的提取 一、实验原理 二、实验操作 1.“S”Buffer提取法 2.简化快速提取法 3.注意事项 4.DNA检测 5.试剂配制 三、实验结果分析 第三节 TENS法提取微生物基因组DNA 一、实验原理 二、实验操作 三、注意事项 1.为什么用无水乙醇沉淀DNA 2.在用乙醇沉淀DNA时，为什么一定要加NaAc或NaCl至最终浓度达0.1～0.25mol/L 第四节 DNA的扩增 一、实验原理 二、实验操作 1.引物 2.PCR扩增反应体系 3 .扩增反应在DNA扩增仪（PTC-100和PTC-225，MJ公司）上进行，反应程序 第五节 DNA片段的琼脂糖凝胶电泳和回收纯化 一、实验原理 二、实验操作 1.电泳装置 2 .琼脂糖凝胶中DNA的检测 3.琼脂糖凝胶的制备及电泳 4.琼脂糖凝胶中DNA片段的回收与纯化 三、实验结果分析 四、常见问题 1.DNA片段分离不良 2.条带涂布 3.凝胶融化 五、解决方法 1.微波炉溶解琼脂糖时，胶液沸腾冲溢出三角锥瓶微波炉加热时胶液可能发生剧烈沸腾 2.琼脂糖电泳图像背景模糊不清 3.加热后水分蒸发 4.DNA条带模糊，拖尾 5.DNA条带淡弱或无DNA带 6.DNA MARKER条带扭曲 六、注意事项 第六节 DNA重组及鉴定 一、实验原理 二、实验操作 1.载体与目的DNA的制备。 2.连接反应 3.转化大肠杆菌 三、实验结果及分析 第七节 核酸分子杂交技术 一、实验原理 二、实验操作 1.严格按照操作程序操作 2.随机引物标记操作程序 三、核酸探针膜上杂交 1.杂交总原则 2.杂交膜的选择 3.探针浓度 4.预杂交和杂交液 5.Southern Blotting 四、原位杂交 1.玻片准备 2.固定 3.玻片上材料的预处理 4.探针和靶基因的变性 5.杂交后的冲洗 6.免疫细胞化学 7.影响原位杂交的主要因素 8.杂交标准条件 五、组织切片的原位杂交 1.探针的准备 2.玻片的处理 3.组织切片的准备 4.杂交 5.冲洗 6.杂交分子的免疫检测 六、细胞的原位杂交 七、各种溶液的配制 八、使用注意事项 第八节 Southern blotting技术 一、实验原理 二、实验操作 1.基因组DNA的提取 2.基因组DNA的酶切 3.琼脂糖凝胶配制 4.电泳结果检测 5.转膜 6.探针的制备 7.探针的标记 8.探针的纯化 9.DNA Marker和λDNA的标记 10.预杂交 11.杂交 12.洗膜（） 13.杂交结果检测（用磷屏仪） 14.探针的剥离和杂交膜的保存 15.实验试剂配制 三、实验结果分析 第九节 植物总RNA的提取和检测 一、实验原理 二、实验操作 总RNA的提取步骤 三、实验结果分析 1.紫外吸收法测定 2.变性琼脂糖凝胶电泳测定 四、注意事项 第十节 poly（A）+RNA的提取 一、实验原理 二、实验操作 第十一节 无菌感染期线虫RNA的提取 实验操作 1.无RNA酶实验用品的处理 2 .感染期线虫总RNA的提取 3.总RNA浓度的测定（紫外分光光度计法） 4.琼脂糖凝胶电泳 第十二节 果蝇总RNA的提取 一、实验原理 二、实验操作 第十三节 哺乳动物RNA的提取 一、实验原理 二、实验操作 第十四节 反转录RNA 一、实验原理 二、实验操作 第十五节 半定量PCR技术 一、实验原理 二、实验步骤 1.样品总RNA的抽提与质量检测 2.样品cDNA合成 3.半定量PCR 三、实验结果分析 第十六节 实时荧光定量PCR技术 一、实验原理 二、实验步骤 1 .单链cDNA摸板的合成（参照反转录RNA） 2 . Real-time PCR操作方法，TIANGEN公司RealMasterMix（SYBR Green）PCR Kit 3.计算 4.注意事项 三、实验结果分析 第十七节 Northern bloting技术 一、实验原理 1.总RNA的变性电泳、转膜 2.探针的准备 3.预杂交 4.杂交 5.洗膜 二、实验结果分析 第十八节 核酸染色 一、DNA和RNA的简单结构 二、Feulgen显示DNA法 三、核仁组成区和酸性黏多糖复合显示法（Combining method for Argy-rophilic proteins of the nucleolar organizer regions and acid musin） 1.试剂的配制 2.操作步骤 四、黏多糖和核仁组成区双染法（Double staining for cabohydrate and ANOR） 1.试剂配制 2.操作方法 3.注意事项 4.临床和研究性应用 第十九节 双脱氧链终止法测序技术 一、实验原理 二、实验操作 1. Sanger双脱氧链终止法（酶法）测序程序 操作程序是按DNA复制和RNA反转录的原理设计的 2.双脱氧测序的示剂及具体操作步骤（以双链DNA测序为例） 第二十节 焦磷酸测序（Pyrosequencing） 一、实验原理 二、焦磷酸测序技术的反应过程 三、焦磷酸测序技术基因分析上的应用 四、焦磷酸测序技术的优点分析 第二十一节 核酸信息分析 一、基因组序列分析工具 1. Wisconsin软件包（ GCG ） 2. ACEDB 3.其他工具 二、人类和鼠类公共物理图谱数据库的使用 1.物理图谱的类型 2.大型公用数据库中的基因组图谱 三、基因组的基因图谱 1.人类基因组的转录物图 2.浏览NCBI转录物图 3. White head Institute提供的人类物理图谱 4. Whitehead放射性杂交图 5. Stanford University放射性杂交图 6. CEPH YAC图 7.特定人类染色体图谱 四、鼠类图谱来源 五、SNP的发现 第三章 蛋白质 第一节 定量蛋白质组学 一、实验原理 二、DeCyder MSTM 三、SILAC（Stable Isotope Labeling with Amino Acids in Cell Cultures） 第二节 植物蛋白的提取 一、实验原理 二、实验操作 （一）氯醋酸—丙酮沉淀法 （二）从Trizol裂解液中分离总蛋白 （三）从新鲜样品中提取疏水性膜蛋白（Triton X-114去污剂法） （四）植物蛋白提取试剂盒Plant Total Protein Extraction Kit （五）一步法植物活性蛋白质提取试剂盒 第三节 动物蛋白质的提取 一、实验原理 二、实验操作 1.培养的贴壁动物细胞的蛋白质抽提步骤 2.培养的悬浮动物细胞的蛋白质抽提步骤 3.哺乳动物组织的蛋白质抽提步骤 第四节 动物细胞器蛋白的提取 一、实验原理 二、实验操作 1.鼠肝匀浆的差分分离程序 2.从沉Ⅱ中纯化线粒体 3.从沉Ⅳ中部份纯化光滑微粒体 4.从沉Ⅰ中部分纯化质膜 5.从上Ⅲ中分离粗糙和光滑微粒体 6.从匀浆中纯化细胞核 7.从沉Ⅰ中纯化细胞核 8.从沉Ⅰ中纯化质膜 9.沉淀Ⅰ中纯化重线粒体 10.从沉Ⅲ中纯化溶酶体及线粒体 11.从沉Ⅲ中纯化溶酶体及线粒体 12.从沉Ⅱ及沉Ⅲ中纯化高尔基膜 第五节 细菌蛋白质的提取 一、实验操作 1.从新鲜样品中提取总蛋白（简易法） 2.分离细菌膜蛋白的方法 第六节 原核表达 一、实验原理 二、实验操作 1.融合基因在大肠杆菌BL21中的诱导表达 2.菌的生长测定 3.纯化蛋白 4.蛋白浓缩 5.蛋白浓度测定 6. SDS-PAGE（polyacrylamide gel electrophoreses）凝胶电泳检测 三、实验结果分析 第七节 用IPTG诱导大肠杆菌表达重组绿色荧光蛋白 一、实验原理 二、实验操作 1.诱导 2.形态观察 三、注意事项 第八节 蛋白质的定量 一、实验原理 二、实验操作 （一）Folin酚试剂法，又名Lowry法 （二）考马斯亮蓝法 （三）紫外分光光度法 （四）双缩脲法 第九节 聚丙烯酰胺变性凝胶电泳 一、实验原理 二、实验操作 1.实验步骤 2.试剂配制 3.聚丙烯酰胺凝胶中DNA片段的回收 三、实验结果分析 第十节 非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳 一、实验原理 二、实验操作 1. PAGE胶电泳缓冲液配制 2. Native-PAGE配方 3. Native-PAGE电泳 三、注意事项 第十一节 双向凝胶电泳 一、实验原理 二、实验操作 1.折叠第一向等电聚焦 2.折叠第二向SDS-PAGE电泳 三、注意事项 1.样品新鲜 2.样品蛋白的总量不少于1 mg 四、实例 1.有关细胞胞外蛋白双向电泳 2.有关样品细菌双向电泳 第十二节 Western bolting技术 一、实验原理 二、实验操作 1.实验操作步骤 2.实验试剂的配制 三、实验结果分析 第十三节 蛋白质转印实验 半干式 一、实验原理 二、实验操作 三、注意事项 第十四节 蛋白质转印实验 电泳液式 一、实验原理 二、实验操作 1.转膜操作 2.组装转移叠层 3.蛋白质转移 4.膜染色 第十五节 蛋白质染色 一、实验原理 二、实验操作 （一）考马斯亮蓝染色 （二）银染法 （三）非铵盐银染法 （四）快速银染法 第十六节 染色质免疫沉淀技术（ChIP） 一、实验原理 二、实验操作 三、qPCR分析 四、qPCR分析中的注意事项 五、Chip-Seq 六、Chip技术的应用 第十七节 凝胶迁移实验（EMSA） 一、实验原理 二、实验操作 1.探针的标记 2.探针的纯化 3.EMSA胶的配制 4.准备跑预电泳 5.准备进行结合反应 6.结合反应产物进行电泳 7.转膜 8.将转移的DNA交联到膜上 三、实例展示（） 第十八节 超迁移EMSA（Super-Shift EMSA） 一、实验原理 二、常见问题 1.为什么看不到迁移带 2.在Super-Shift EMSA测定中看不到Super-Shift DNA/蛋白复合物带还可能有以下原因 3.为什么实验背景高 4 . EMSA测定需要多少量的蛋白与标记的探针 5 . Poly（dI:dC），非特异性竞争DNA，特异性竞争DNA在EMSA测定中的作用 6.用什么凝胶条件将蛋白质/探针复合物和游离的探针分离开 第十九节 蛋白质序列分析 1 . UniProt-通用蛋白质资源库 2 . iProClass-蛋白质知识整合数据库 3 . PIRSF-蛋白质家族分类系统 4 . iProLINK-蛋白质文献、信息和知识整合数据库 第四章 载体构建及扩繁 第一节 DNA限制性内切酶酶切分析 一、实验原理 二、实验操作 三、实验结果分析 四、注意事项 1.内切酶 2 .底物的DNA 3.反应缓冲液 4.酶解温度 5.时间 6.各成分混匀 7.反应终止—终止内切酶反应的方法 8.酶解完成后，不必立即终止反应 9.酶切星号活力（star activity） 第二节 PCR产物连接 一、实验原理 二、实验操作 第三节 连接产物的转化 一、实验原理 二、实验操作 （一）热激法 （二）CaCl_(2)法 （三）一步法 （四）高效率电转法 三、实验结果分析 第四节 挑菌与摇菌 一、操作流程 二、附：TB培养基配方 第五节 保菌 一、操作流程 二、附冻存培养基配方 第六节 菌液PCR检测 一、操作流程 二、相关反应程序 第七节 质粒提取 一、实验原理 二、实验操作 1.试剂盒提取质粒 2. 96孔板提取质粒 3.质粒培养和提取所需溶液的配制 三、注意事项 第八节 质粒DNA的电泳检测 一、实验原理 二、实验步骤 三、实验结果分析 第九节 ABI 3730 XL测序实验程序 一、菌的培养 二、菌的保存：96孔板回接384板上的保菌过程 三、提取质粒的基本步骤 四、测序反应 五、实验步骤 六、PCR产物纯化 七、ABI 3730 XL上机操作 八、3730 XL测序仪日常维护 九、测序质量的监控 十、附配方（） 第十节 感受态细胞的制备 一、实验原理 二、实验操作 1.大肠杆菌感受态细胞的制备 2.农杆菌感受态细胞的制备 第十一节 农杆菌转化法 一、电击法 二、热激法 第十二节 基于毛细管电泳的荧光检测SSR实验程序 一、SSR荧光引物的标记 1.直接标记 2.标记M13接头链 二、PCR扩增 1.第一次扩增 2.第一次PCR程序 3.第二次扩增 4.第二次PCR程序 三、荧光检测 1.扩增产物的纯化 2.扩增产物的荧光检测 四、数据分析 第五章 蛋白质—蛋白质相互作用 第一节 目标蛋白的亚细胞定位 一、实验原理 二、实验步骤 1.基因枪轰击法 2.原生质体转化 3.溶液配制 三、实验结果分析 第二节 酵母双杂交 一、实验原理 二、实验操作 1.酵母双杂交系统的组成 2.实验步骤 三、酵母双杂交系统的应用 四、酵母双杂交体系的缺陷 1.它并非对所有蛋白质适用 2.假阳性的发生较为繁多 3.毒性作用 4.相互作用 第三节 酵母文库的筛选 一、筛选内容与过程 二、母液配制 三、YPAD培养基配制 四、SD培养基配制 第四节 免疫共沉淀 一、实验原理 二、实验操作 1.烟草叶片总蛋白的提取及免疫共沉淀反应 2.SDS-PAGE电泳 3.Western blot检测 第五节 GST融合蛋白进行Pulldow实验 一、实验原理 二、实验操作 三、流程图 四、两种应用 第六节 双分子荧光互补（BiFC） 一、实验原理 二、实验操作 三、注意事项 四、双分子荧光互补（bimolecular fluorescence complementation，BiFC）的应用 五、双分子荧光互补（bimolecular fluorescence complementation，BiFC）的优缺点 六、双分子荧光互补（bimolecularfluorescence complementation，BiFC）的延展 第七节 荧光共振能量转移[Fluorescence resonance energy transfer（FRET）] 一、实验原理 二、FRET技术的应用 第八节 Far Western blotting印迹法 一、实验原理 二、Far-Western Blotting试剂盒 第九节 酵母单杂交实验 一、实验原理 二、实验操作 三、用途 第十节 原生质体提取及转化步骤 一、实验原理 二、实验操作 1.酶解液配方10 ml（可以酶解至少90片叶片） 2.原生质体提取 3.转化 三、注意事项 第六章 作物转化 第一节 浸蘸法转化拟南芥 一、实验原理 二、实验操作 1.转化步骤 2.转基因植株的检测 3.纯系转基因植株的获得 三、实验结果分析 第二节 农杆菌侵染法转化烟草 一、实验原理 二、实验操作 1.无菌苗的诱导 2.菌株活化 3.转化步骤 4.转基因植株的检测 5.转基因烟草纯系的获得 三、实验结果分析 第三节 烟草瞬时表达 一、实验原理 二、实验操作 第四节 农杆菌侵染法水稻 一、实验原理 二、实验操作 1.水稻转化受体的准备 2.农杆菌的培养 3.水稻愈伤组织与农杆菌的共培养 4.抗性愈伤组织的筛选 5.抗性愈伤组织的分化 6.生根、壮苗和移栽 7.附：培养基配方 第五节 生理指标的测定 一、叶绿素的测定 1.叶绿素的提取 2.叶绿素的测定 3.叶绿素a和叶绿素b的浓度计算 二、可溶性糖的测定 1.可溶性糖的提取 2.配置可溶性糖的标准曲线 3.可溶性糖含量的测定 4.可溶性糖含量的计算 三、丙二醛含量的测定 1.丙二醛的提取 2.丙二醛含量的测定 3.丙二醛含量的计算 四、相对电导率的测定 1.相对电导率的滤液提取 2.相对电导率的计算 五、脯氨酸含量的测定 1.脯氨酸的提取 2.配置脯氨酸的标准曲线 3.脯氨酸含量的测定 4.脯氨酸含量的计算 第七章 常用试剂的配制 第一节 抗生素溶液的配制 一、红霉素溶液的配置和注意事项 二、氯霉素溶液的配置和注意事项 三、氨苄青霉素（ampicillin） 四、羧苄青霉素（carbenicillin） 五、卡那霉素（kanamycin） 六、链霉素（streptomycin） 七、甲氧西林（methicillin） 八、利福平（Rif） 第二节 常用缓冲液的配制 一、甘氨酸-盐酸缓冲液（） 二、邻苯二甲酸-盐酸缓冲液（） 三、磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液（） 四、柠檬酸-氢氧化钠-盐酸缓冲液（） 五、柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液（） 六、醋酸-醋酸钠缓冲液（） 七、磷酸二氢钾-氢氧化钠缓冲液（） 八、磷酸盐缓冲液 磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液（） 九、巴比妥钠-盐酸缓冲液（） 十、Tris-HCl缓冲液（） 十一、硼酸-硼砂缓冲液（） 十二、甘氨酸-氢氧化钠缓冲液（） 十三、硼砂-氢氧化纳缓冲液（） 十四、碳酸钠-碳酸氢钠缓冲液（）（此缓冲液在Ca^(2+)、Mg^(2+)存在时不得使用） 第三节 常用培养基的配制 一、细菌培养基 1.配方一 牛肉膏琼脂培养基 2.配方二 马铃薯培养基 3.配方三 根瘤菌培养基 二、放线菌培养基 1.配方一 淀粉琼脂培养基（高氏培养基） 2.配方二 面粉琼脂培养基 三、真菌培养基 1 .配方一 萨市（Sabouraud's）培养基 2.配方二 马铃薯糖琼脂培养基 3.配方三 黄豆芽汁培养基 4.配方四 豌豆琼脂培养基 四、食用菌菌种培养基 1.配方一 马铃薯—蔗糖—琼脂培养基 2.配方二 综合马铃薯培养基 五、选择性培养基 1.配方一 酵母菌富集培养基 2 . Ashby无氮培养基 3.配方二 鉴别培养基 参考文献 封底 ..更多